各种血红蛋白的等电点不同的特点,在一定pH缓冲液中所带的正、负电荷不同,经电泳后各血红蛋白的移动方向不同。
电泳法 HbA95%、HbA21.1%~3.2%、HbA32%~3%。
Singer法HbF<4%。
1、主要成分为HbS,而无HbB,可见于镰形细胞血红蛋白病。
2、HbS、HbF和HbA2轻度增加,而HbA极少或消失,结合调查可诊断为HbS-β-海洋性贫血,多见于地中海地区。
3、除HbS外,含有10%-30%HbA和轻度增高的HbF及HbA2,也可考虑HbS-β-海洋性贫血。
4、HbS占20%-30%,HbA占65%-75%,并含有正常的HbF和HbA2,可诊断为HbS-α-海洋性贫血。
5、HbA消失,HbC占总血红蛋白的28%-44%,可诊断为血红蛋白病,多见于黑人,血片中可见较多的靶形细胞。
6、有HbS,还出现HbD,血片中有靶形细胞,可诊断为血红蛋白D病,我国北方较多见。
7、电泳结果出现HbE,可诊断为血红蛋白E病,主要见于东南亚、印度等,我国以广东南部多见。
蜡酸纤维薄膜电泳直接比色法
试剂:同醋酸纤维素膜微量血红蛋白电泳。
操作:
(1)将醋酸纤维素膜作1/3切开(4cm×8cm)漫于TEB缓冲液中,10min以上。
(2)取出醋酸纤维素膜用滤纸吸去多余的水份。以Hb吸管吸取100g/L溶血液10μl均匀涂于玻璃推片下缘,在距薄膜阴极端1.5~2.0cm处于无光泽面点样。每个标本同时做两份。
(3)电泳:缓冲液同微量血红蛋白电泳。电压180V,时间40min~1h。(以各区带明显分开为宣)电泳后交换电极,缓冲液可反复使用。
(4)洗脱与定量 分别剪下HbA,HbA2和相当于HbA2大小的对照区带。如有异常Hb区带(HbX)也同时剪下,各自放在相应的试管中。于HbA管中加TEB缓冲液10ml,其余各管加TEB缓冲液2ml,浸泡30min,时时振摇。待完全洗脱后。将洗脱液混匀,用721分光光度计,波长413nm。以空白调零,测各管吸光度。
(1)微量血红蛋白电电泳:
①浸膜:将醋酸纤维素膜漂浮于TEB缓冲液表面,待其均匀浸透沉下后,至少20min才可使用。这样可防止产生气泡。
②点样:取出醋酸纤维薄膜用滤纸吸去多余的水份。用微量吸管吸取血红蛋白溶液置于多标本加样器的凹型槽内,以多标本加样器蘸取血红蛋白液,点样于醋酸纤维素膜无光泽面。距阴极端1.5~2cm处,点样量约3~5μl同时平行地点上正常血红蛋白溶液作对照。
③电泳:在微型电泳槽两侧缓冲液槽内分别加入等量的BB缓冲液,以二层滤纸做盐桥搭在醋酸纤维薄膜支架上。将膜无光泽面向下,点样端接负极,平衡5min。接通电源。电压180V,电流量约为0.2mA/cm膜宽,电泳时间20~30min。槽中缓冲液可在倒换电极后再用1次。
④染色:电泳后的薄膜放在丽春红染色液中染色10min左右取出,用3%醋酸漂洗数次,至背景呈白色,阴干。
⑤透明:将醋酸纤维素膜置透明液中浸湿,贴于洁净玻璃板上,用玻棒赶去二者之间的气泡。于一层析缸内倒少量冰醋酸,将玻璃板反盖在层析缸上(有薄膜面向内)。以挥发的冰醋酸熏10~20min,待膜透明即可取下。
(2)醋酸纤维素膜电泳染色比色法:
①将TEB缓冲液浸泡过的4cm×6cm的醋酸纤维素膜取出,用滤纸吸干多余水分。于无光泽面距阴极端1.5cm处,用血红蛋白吸管直线状均匀整齐地滴加50g/L Hb溶液约5μl,待血红蛋白液渗入膜内后,将膜翻转置电泳槽支持板的滤纸桥上。
②电泳:电压180V,时间30~40min,以Hb各区带完全分离为准。电泳后交换电极,电泳缓冲液可多次使用。
③染色:将膜浸入染色液中,冬天需染2h,夏天或将染缸置25~30℃.可只染30min左右。注意如染色不透(如时间太短或血红蛋白溶液过浓),或电压过高使HbA带过于集中,易致色带剥脱,均影响定量的准确性。染毕用漂洗液洗数次,至背景漂净为止。
④定量:将漂净的膜取出,分别剪下各区带,及相当于HbA2大小的对照区带,各自放在相应的试管中。于HbA管中加浸出液10ml,其余各管加浸出液2ml,浸泡20min,时时振摇。使色带完全洗脱(注意在气温较高时,洗脱时间不可过长,否则洗脱液蓝色减退,并逐步变为紫红色)。将洗脱液混匀,用721分光光度计,波长620nm,以空白调零,测各管吸光度。
⑤计算:同直接比色法。
蜡酸纤维薄膜电泳直接比色法
试剂:同醋酸纤维素膜微量血红蛋白电电泳。
操作:
(1)将醋酸纤维素膜作1/3切开(4cm×8cm)漫于TEB缓冲液中,10min以上。
(2)取出醋酸纤维素膜用滤纸吸去多余的水份。以Hb吸管吸取100g/L溶血液10μl均匀涂于玻璃推片下缘,在距薄膜阴极端1.5~2.0cm处于无光泽面点样。每个标本同时做两份。
(3)电泳:缓冲液同微量血红蛋白电电泳。电压180V,时间40min~1h。(以各区带明显分开为宣)电泳后交换电极,缓冲液可反复使用。
(4)洗脱与定量 分别剪下HbA,HbA2和相当于HbA2大小的对照区带。如有异常Hb区带(HbX)也同时剪下,各自放在相应的试管中。于HbA管中加TEB缓冲液10ml,其余各管加TEB缓冲液2ml,浸泡30min,时时振摇。待完全洗脱后。将洗脱液混匀,用721分光光度计,波长413nm。以空白调零,测各管吸光度。
无禁忌人群。
感染的风险:如果使用了不洁针头穿刺就有可能有感染的风险。